支原体检测中「方法验证」的必要性

核酸扩增技术与支原体检测

自1988年以PCR为代表的核酸扩增技术问世以来，该技术已广泛应用于科研和临床，但由于标准化的建立需要一定的时间，因此用于生物制药则相对较晚。

国外已有不少药厂将PCR或qPCR用于工业放行检测中的支原体检查。PCR或qPCR的灵敏度、特异性、适用性和可靠性具有达到药典标准的潜在可能。但需要按步骤和程序开展方法验证。

支原体检测方法验证

有研究人员指出，有些PCR检测法，在反应条件及引物设计上，仍需不断改良以提高其检测效率。曾有研究人员，用半巢式PCR检测70份支原体污染的样本（主要为生物制品生产用细胞基质），结果只检出60份，说明PCR要应用于工业检测支原体，其首要因素是要提高检测限。

传统支原体检查方法是培养法和指示细胞培养法，并为药典所认可和收录。近年来，支原体qPCR检测在工业领域的应用越来越多，但在项目申报前，先需要进行方法学验证，依据药典，在检测限、特异性和耐用性方面达到要求后，才能替代传统的检查方法。

好物推荐

支原体qPCR检测试剂盒因其操作时间短（仅需2-3小时）、灵敏度和特异性高而广受科研人员青睐。

目前国外药厂放行检测（product release testing）采用的较多的是德国Minerva Biolabs(简称MB)公司的Venor® Gem qEP (qPCR法)和Venor® Gem Classic(常规PCR法)。Venor® Gem qEP由于无须跑胶，且能定量，因而使用更为便捷。

MB Venor® Gem qEP 试剂盒的特点：

1）使用灵活

* 与几乎所有商用循环仪兼容

* 可选择常规PCR或实时荧光定量PCR

2）高性能

* 高耐用性、高灵敏度和高特异性（>100种支原体物种可检测）

* 符合EP 2.6.7 / USP <71> / JP G3标准。提供内部扩增对照，

用于过程监测。有产品验证报告

3）使用方便

* 预先分装PCR mix（25个反应），保证长期稳定性

* 组分为冻干粉形式，使运输与存储更简单

* 探针检测，结果清晰（qPCR）

可考虑的标准品需要经过严格标定。需考虑有国际声誉和质控报告的标准品厂家。下面介绍某厂家标准品类别如下：

配套用于过程验证和检测的标准品（EP2.6.7/USP<71>/JP G3）：

* 10CFU™灵敏度标准品，包括所有EP和JP列举的支原体物种

* 100CFU™灵敏度标准品

* 支原体和细菌基因组DNA（特异性验证用）

* PCR定量标准品（108拷贝DNA/管）