活细胞观察活性染料固定染色法

一.活细胞观察

镜下观察：

细胞无色透明，倒置显微镜或相差显微镜观察细胞形态结构：细胞膜和细胞质。

生长状态好:胞内无颗粒,不见空气,胞膜清晰,上清液透明，无悬浮细胞和碎片。

生长状态不好：胞质出现空气脂滴和颗粒状物，细胞之间的空隙加大细胞形态不规则。

1.活性染料：

原理：能进入活细胞,一些无毒或毒性很小的染料,电性吸引而堆积在细胞中某些特定的结构从而显色,不引起物理和化学变化,对细胞生命活动不会产生影响或影响很少。

包括：中性红、结晶紫、健那绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫。

特点：它们解离后带正电荷，属碱性染料与胞内构造有一些结合。

二．固定染色方法

1．固定：迅速杀死细胞再染色进行观察。

目的：使细胞内的蛋白质、脂肪、核酸及糖等转变为不溶性物质，避免自溶腐bai。固定的细胞保持原有结构，保存时间长。

由于固定剂性能不同，如一种固定剂对某种结构保存效果好，但对别的结构就不一定适合，染色剂对细胞内的各种化学成分有不同的亲和力，所以每种组织通常有一些特定的固定染色方法。

一.常用固定剂包括:

1.75％酒精、

2.4％多聚甲醛（多聚甲醛为粉末状，缓慢加入在60℃水浴中溶化），

3.甲醛/冰醋酸（冰醋酸1份：甲醛3份），

4.FAA（80％乙醇90ml、冰醋酸5ml、中性福尔马林5ml）

5.中性福尔马林：福尔马林10ml、Na2HPO4(无水)0.78g、NaH2PO4(无水)0.42g加0.85%NaCl至100ml。

6.Carnory固定液：纯酒60ml、氯仿30ml、冰醋酸10ml。

二. 染色方法：

使死细胞着色的大多数是酸性染料，它们不易穿透活细胞的质膜，进入胞内，却能渗进死亡的细胞，使死细胞着色。

（1）台盘蓝(trypan bule)

0.4%～1%溶于生理盐水，pH7.0～7.2，取0.1ml/ml细胞悬液染色2分钟后镜下观察死细胞为蓝色。此染色时间不易过长，有毒性，如染15分钟以上，活细胞会受到损伤而着色。另外，台盘蓝不宜久存时间长了有毒性。（蓝色）

（2）苯胺黑 (Amiline black)

0.05%苯胺黑Hanks溶液以1：10量细胞悬液混合1～2分钟后，镜下观察：死细胞着黑色，苯胺黑染料毒性很小。

（3）赤藓红B(Erythrosin B)

PBS或Hanks溶液洗去血清取细胞与0.02%赤藓红B混合，两小时之内镜检:死细胞着红色。

（4）伊红Y(Eosin Y)

细胞悬液与7倍量的0.15%伊红Y染液（生理盐水配制）混合2分钟后镜检，死细胞为桃红色。

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