上皮细胞体外培养的特殊条件

上皮细胞体外培养的特殊条件

(1)防范微生物污染：

根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。

要求在组织取材时就严格灭菌；

分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。

培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。

(2)生长基质的支持：

上皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。

在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。

(3)特殊的培养基：

培养基有M199、RPMl 1640、DMEM和HamFl2。

其中以M199和RPMl 1640较为常用。

M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。

DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。

可促进上皮细胞的贴附；

维持上皮细胞在体外培养状态的分化。

HamFl2培养基的特殊性

特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。

在实际培养时，将DMEM与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。

加入血清，但出厂血清成分复杂，含有一定量的有毒物和抑制物。

(4)去除成纤维细胞：

上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。

取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长"为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源"。

因在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。

内皮细胞：

来源：人脐带脐静脉，动物动脉

消化：用胶原酶比胰蛋白酶消化好。

但要注意掌握消化时间和杂细胞（成纤维细胞和平滑肌细胞）。

内皮细胞的鉴定

用免疫组化染色检测VIII因子相关抗原和CD34抗原, 鉴定内皮细胞。

观察细胞是否呈单层贴壁生长, 细胞形态，如长梭形、多角形三角形、四边形为主, 呈典型的“铺路石"样征象 ；

观察第三代细胞纯度是否达95%以上。

如消化时间过长或操作不慎、刮取过重时，会造成血管内皮下层与外膜成纤维细胞以及中膜平滑肌细胞污染。由于这些杂细胞生长较快，随着传代次数越多，其污染的程度越重，从而使培养失败。

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