划重点：细胞培养该如何应对支原体污染！

细胞培养物被支原体污染是极普遍的问题，面对支原体污染给细胞培养带来的巨大难题，世界各国开始重视，并相继建立了细胞库，对细胞质量进展控制，效guo显著，支原体污染的问题得以限制。目前已知能污染细胞的支原体有20多种以上，其中95％以上的支原体污染是口腔支原体。

支原体的污染来源

（1）细胞之间交叉污染；

（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等；

（3）工作环境或实验器材的污染；

（4）培养基的污染。

支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养和器材要保证无菌；在细胞培养中加入适量的抗生素。

1、支原体检测

荧光定量PCR法（qPCR）：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。

优点：①灵敏度高、特异性强。

②时间短，2-3小时出结果。

③检测结果可定量。

④操作简便。

缺点：①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）

②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在专业人员推荐指导下使用。

德国MB公司生产的支原体qPCR检测试剂盒（均为探针法检测），依据操作步骤的细微差别，

分『经典法』和『一步法』两种。

2、环境空间消毒方案

试验台、超净台、培养箱、液氮罐、移液器、门把手、电话等细胞培养环境

被支原体污染，可引起细胞的污染。应定期对工作区域进行消毒。

德国MB生产的Mycoplasma-offTM喷雾剂，或湿巾擦拭 5-10分钟清除，对支原体、细菌、真菌、霉菌、孢子祛除确切有效。无残留, 无腐蚀, 无致癌性，操作简单方便。

qPCR法介绍：

荧光定量PCR法（qPCR）：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。

优点：①灵敏度高、特异性强。

②时间短，2-3小时出结果。

③检测结果可定量。

④操作简便。

缺点：①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）

②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在专业人员推荐指导下使用。